通常情况下，遗传病的诊断要么是参考已知变异数据库，要么通过解读指南来进行变异解读，只有在确定变异是致病/可能致病，良性/可能良性时，才能给患者明确的诊断结论（如产前诊断告知家属胎儿是要还是不要，辅助生殖中做PGT等）。对于患者中检测到的意义不明的变异（VUS），医生通常无法给出确切的诊断结果。本周分享1例遗传病的从头诊断病例，花了近2年时间才确定变异的致病性，变异经过体外功能实验验证后才给病人下诊断结论。这类病例在文献中比较常见，本期我想分享一例自己接触到的病例，病例中的功能验证实验也可供大家参考。
先证者C诊断为“全面发育迟缓、癫痫、小头畸形、肌张力低下、特殊面容、大脑与小脑萎缩等”。先证者来做检测时孕妇已经怀了二胎D，当时没有给先证者确诊，孕妇B选择生下二胎，二胎D出现了相同症状。两个患者都做相关检测，未确定致病突变，但是找到高度怀疑的复合杂合突变。后面用患者的样本来做科研，2年后才完成科研工作，确定患者的变异为致病突变，文章发表后才下诊断结论，补发了科研报告。
临床信息
先证者系第一胎第一产，足月顺产，出生体重3.4kg，出生时有病例*疸史，医院诊断为“新生儿高胆红素血症”、“新生儿肺炎”，予住院治疗。生后辅食喂养，有吐奶现象，自由发育落后，至今不能顺头。不能追光追物，不会与人用语言交流。4月时有癫痫发作，频率高，持续时间久，可长达数小时，甚至一天，表现为手脚抽搐、口角左侧歪斜等。层于医院行脑电图检测，结果提示异常胎儿脑电图，代谢筛查以及听力，视力检测均未见异常。年5月来我院行相关基因检测。
先证者弟弟年1月出生后，与先证者有相同症状。
两名患者均进行了头部MRI检测，2岁零8个月时的脑磁共振成像（MRI）显示进行性全脑萎缩，包括大脑、小脑和胼胝体萎缩，以及髓鞘形成延迟（见下图）。
家系图：检测结果
CNV-Seq检测结果为阴性，未检测到非整倍体或kb以上的变异。
全外检测结果如下：
sanger测序点验证
上述变异中，NM_.2(PIGK):c.87dupT(p.I30Yfs*10)为功能丧失型突变，很容易评为可能致病（PVS1+PM2），但是NM_.2(PIGK):c.GC(p.DH)位点的变异评级证据为（PM2+PM3+PP3），只能评为意义不明。
PIGK基因功能简介
PIGK基因是编码糖基磷脂酰肌醇（GPI）转氨酶的一个关键组成部分，最近被报道与遗传性GPI缺乏症。GPI锚定是一种存在于许多细胞上的糖脂，用于将蛋白质锚定到细胞表面。
当时由于高度怀疑为PIGK基因致病，因此对当前突变做了功能验证。
功能验证实验如下：
1）斑马鱼PIGK基因敲减实验：
实验采用的是MorpholinoKnockdown技术进行的敲减，共设计了两个探针。分别位于起始密码子（MO1），另一个位于剪切位点（MO2），可以发现经过敲减后的胚胎死亡和发育异常的数量显著提升。共注射斑马鱼PIGKmRna（RES组，pg/胚胎）部分挽救了异常表型。斑马鱼神经细胞实验：
采集患者及其家属的外周血分离淋巴细胞进行建株，PIGK基因及其蛋白定量结果表明，患者的PIGK基因mRNA表达上调（显著高于父母和对照），PIGK蛋白westertbolt结果表明不论是患者还是携带者的PIGK蛋白的表达量均低于对照。淋巴细胞膜表面GPI-APs定量结果：
上述斑马鱼PIGK敲减实验，只能证明PIGK基因功能丧失会致病，导致斑马鱼畸形和神经细胞异常，但不能说明当前病例中变异的致病性。
文章中还做了同源基因Knowin实验。人类（npu）和小鼠（npu）PIGK蛋白序列的同源性高达91.4%，且患者的两个突变位点在不同物种间高度保守，研究人员通过CRISPR/Cas9在小鼠PIGK中引入了同源移码突变和错义突变，分别构建F0代小鼠，F0全部为杂合小鼠。F0杂交后产生与患者有相同变异的F1代小鼠。在获得PigkWt/I30fs和PigkWt/DH小鼠品系后，在每个品系的杂合子雄性和雌性之间进行交叉交配。通过对PigkWt/I30fs×PigkWt/I30fs组5窝29只幼崽，和PigkWt/DH×PigkWt/DH组6窝的26只幼崽进行基因分型，发现即使在错义突变组中，也没有发现纯合子突变幼崽，这意味着小鼠Pigk双等位基因突变的胚胎致死性和错义突变的明显致病性。杀死4只怀孕13.5天的雌性小鼠，结果表明PigkWt/I30fs×PigkWt/I30fs配对组37枚胚胎中有13枚消失或吸收，PigkWt/DH×PigkWt/DH配对组35枚胚胎中有8枚消失或吸收。存活的胚胎均为野生型或杂合型，说明PIGK纯合突变/复合杂合突变的动物胚胎有很高的致死率。通过上述的体外功能实验，证实两名患者中的两个突变均为致病突变。
文章发表后，给患者家属补发了科研报告，变异解读和咨询意见内容如下：
结果解读
1.PIGK基因突变可导致常染色体隐性遗传的神经发育障碍、肌张力低下和小脑萎缩，伴或不伴癫痫（NEDHCAS）。
2.根据以上检测结果，提示2-1（C）和2-2（D）为PIGK基因c.GC和c.87dupT复合杂合突变导致的NEDHCAS，其1-1（A）为PIGK基因c.GC杂合突变携带者，其母1-2（B）为PIGK基因c.87dupT杂合突变携带者。
咨询意见
1.建议A（I-1）与B（I-2）再次生育时对胎儿行行产前诊断或胚胎植入前诊断。
2.建议遗传咨询。
变异的评级证据
#NM_.2(PIGK):c.GC(p.DH)
体外功能试验以明确会导致基因功能受损的变异（PS3）；
该变异等位基因在0G/ExAC/gnomAD等正常人群数据库中均未收录（PM2）；
隐性遗传病，在反式位置上检测到致病变异（PM3）;
多种软件预测该变异会对基因产物造成有害的影响（PP3）；
该患者的表型和神经发育障碍、肌张力低下和小脑萎缩，伴或不伴癫痫（NEDHCAS）（OMIM:）高度一致（PP4）。
#NM_.2(PIGK):c.87dupT(p.I30Yfs*10)
在一个已知致病机制的疾病中，关键基因发生丧失功能的变异（PVS1）；
体外功能试验以明确会导致基因功能受损的变异（PS3）；
该变异等位基因在0G/ExAC/gnomAD等正常人群数据库中均未收录（PM2）；
如果不过不做功能验证的话，移码突变位点（PIGK):c.87dupT）可以评为可能致病，但是错义突变位点（PIGK):c.GC）不能评为致病。完成体外功能验证试验后，才给补充上了PS3证据，两个位点的变异评级都升为致病。
参考文献：
XinChen,WuYin,SiyiChen.etal.LossofPIGKfunctioncausessevereinfantileencephalopathyandextensiveneuronalapoptosis.HumGenet..1.4.doi:10.7/s---2
CasideXiao